임병1(B) - 4. Erythrocyte (Ch.3)

Table of Contents

(누르면 이동하는 건,, 여기서 구현이 안됨 ,, ㅠㅠ 순서만 쭉 보세용 ㅠ)

• Ⅰ. Erythron
• Ⅱ. Erythrocyte kinetics in health
  • [[#Ⅱ. Erythrocyte kinetics in health#(1) 골수 (Erythrocyte precursors)|(1) 골수 (Erythrocyte precursors)]]
  • [[#Ⅱ. Erythrocyte kinetics in health#(2) 순환 혈중 (Blood erythrocytes)|(2) 순환 혈중 (Blood erythrocytes)]]
  • [[#Ⅱ. Erythrocyte kinetics in health#(3) 비장 (Splenic erythrocytes)|(3) 비장 (Splenic erythrocytes)]]
• ✅ 동물별 정상 RBC 비교
• Ⅲ. Hgb
  • [[#Ⅲ. Hgb#Hgb synthesis|Hgb synthesis]]
  • [[#Ⅲ. Hgb#Hgb degradation|Hgb degradation]]
• Ⅳ. Fe
  • [[#Ⅳ. Fe#Absorption|Absorption]]
• Ⅴ. Mature erythrocyte metabolism
• Ⅵ. Reticulocytes
  • [[#Ⅵ. Reticulocytes#Feline Reticulocytes의 종류|Feline Reticulocytes의 종류]]
• Ⅶ. Blood groups or types
• Ⅰ. Erythrogram
• Ⅱ. Methods
  • [[#Ⅱ. Methods#(1) Microhematocrit|(1) Microhematocrit]]
  • [[#Ⅱ. Methods#(2) Impedance cell counters|(2) Impedance cell counters]]
  • [[#Ⅱ. Methods#(3) Laser flow cell cytometers (+Cytogram 분석📋)|(3) Laser flow cell cytometers (+Cytogram 분석📋)]]
• Ⅰ. Assessment
• Ⅱ. General Features
  • [[#Ⅱ. General Features#Mature RBC = Discocytes (정상 적혈구)|Mature RBC = Discocytes (정상 적혈구)]]
  • [[#Ⅱ. General Features#Rouleaux formation or Agglutination|Rouleaux formation or Agglutination]]
  • [[#Ⅱ. General Features#Rubricytosis|Rubricytosis]]
• Ⅲ. RBC Color
• Ⅳ. RBC Organisms
• Ⅴ. RBC Inclusions (other than organisms)
• Ⅵ. Abnormal Erythrocyte Volume
• Ⅶ. Abnormal Erythrocyte Shape
• Ⅰ. General information
• Ⅱ. Classifications of anemias
  • [[#Ⅱ. Classifications of anemias#⏺️ Bone marrow의 반응성|⏺️ Bone marrow의 반응성]]
  • [[#Ⅱ. Classifications of anemias#⏺️ RBC indices에 따른 세포의 mophologic classification|⏺️ RBC indices에 따른 세포의 mophologic classification]]
  • [[#Ⅱ. Classifications of anemias#⏺️ Pathophysiologic classification|⏺️ Pathophysiologic classification]]
• Ⅰ. General concepts
• Ⅱ. Disorders that cause nonregenerative anemias
• Ⅰ. Causes of blood loss
• Ⅱ. Classification based on duration and location
• Ⅰ. Concepts and classifications
• Ⅱ. Hemolytic disorders and diseases
• Ⅰ. Terms and concepts
• Ⅱ. Erythrocytotic disordes and conditions

단원 목표

• 빈혈은 골수의 반응성 유무에 따라 비재생성 빈혈과 재생성 빈혈(by blood loss or hemolysis)로 구분할 수 있다.
• Erythrogram만 보고도 어떤 빈혈인지 판단할 수 있어야 한다 !!
  • 빈혈 진단이 제일 핵심 포인트
    (Erythrocytosis, polycythemia는 자주 보이는 케이스가 아님. 다른 RBC 관련 질환들도 대부분 유전적으로 발생하는 것이지, 실제로 보게 되는 케이스는 제한적.)
• 그 외, 혈중 Fe 농도를 평가하는 방법과 blood typing의 종류도 배울 것.

추가 사진 from 남내

Physiologic Processes

Ⅰ. Erythron

• RBC 계통의 모든 세포. (간, 비장, 골수, 혈관의 모든 erythrocyte와 precursors가 포함된다.)
• 다양한 cytokines가 EPO와 같이 자극을 유발하면 → BFU-E로부터 RBC precursor 가 생성된다.
  * BFU-E : blast-forming unit-eythroid
• Erythropoiesis는 hematopoiesis 중 하나로 포함된다.

EPO(erythropoietin)

Erythropoiesis를 자극하는 호르몬.
태아기에는 간에서, 성체에서는 신장의 renal peritubular interstitial cell에서 주로 생산된다.

• Renal hypoxia에 대한 반응으로 EPO가 생산되면 → EPO가 erythropoiesis를 유도.
  • Renal hypoxia : 빈혈이나, 폐질환, 산소 교환 부족, 신장 관류 이상 등으로 발생
• 따라서 골수가 아니라 EPO를 생성하는 신장에 문제가 생겼을 때도 빈혈이 나타날 수 있다.
• CKD는 개보다 고양이에서 많이 나타나는데(개는 1/5 수준, 고양이는 절반/5 수준),
  CKD가 있으면 renal peritubular interstitial cell에서 EPO를 잘 생성하지 못해 빈혈이 발생한다.

• RBC 계통의 세포는 골수에 있는 세포, 혈액 중 순환하는 세포, 비장에 저장된 세포로 구분할 수 있다.

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Ⅱ. Erythrocyte kinetics in health

골수 / 순환 혈중 / 비장 저장의 3가지 형태.

(1) 골수 (Erythrocyte precursors)

• CFU-E → rubriblast(Rb) → prorubricyte(Pr) → rubricyte(Rc)로 분열하고,
  metarubricyte(Mr) → reticulocyte(Rt) → eyrthrocyte(E)로 성숙하는 과정이 관찰된다.
• 성숙할수록 핵의 형태가 왜곡되면서 점점 segmented되던 WBC와 달리,
  RBC는 성숙하면서 세포 크기는 작아지고, 핵은 round한 형태를 유지한다.

Reticulocyte

• Metarubricyte → reticulocyte가 되면서 탈핵이 일어나고 mature RBC와 유사한 anucleate cell이 된다.
  • 탈핵된 핵은 macrophage에 의해 탐식된다.
• 그러나 여전히 염색될 수 있는 RNA 잔여물들이 세포질에 남아있기 때문에 RBC처럼 명확하게 호산성을 띠지는 않고, metarubricyte처럼 여전히 호염성과 호산성이 섞여 있는 염색성을 나타낸다.
• Reticulated form(그물 모양)으로 염색성이 존재하기 때문에 ‘reticulocyte’ 또는 ‘polychromatophilic erythrocyte’라고 부른다.

• Hemoglobin 합성은 rubriblast → reticulocyte까지, 즉 mature RBC가 되기 전까지 지속적으로 나타난다.
• 또한 헤모글로빈 합성이 완성될 때까지는 세포 분열이 일어난다.
  세포 크기당 헤모글로빈 적정 농도를 맞출 때까지 분열이 일어나는 것이 RBC 성숙 분화의 특징!
  • 따라서 ‘Hemoglobin 합성이 일어나고 있다’ = ‘immature RBC이다’

(2) 순환 혈중 (Blood erythrocytes)

• 핵이 없는 mature RBC 형태로 혈중으로 방출되어 우리가 아는 산소 운반의 역할을 수행한다.
• 건강한 포유류에서 시간/체중(kg)당 250 million RBC의 cell death가 일어난다.
  • Life span을 다한 old RBCs는 splenic, hepatic, bone marrow 등의 tissue macrophage에 의해 제거된다.
  • 죽을 때가 된 나이든 RBC들은 spheroid(3차원 구) 형태로 모양이 바뀌고, sinus 통과도 감소한다.

(3) 비장 (Splenic erythrocytes)

• 비장에서는 mature RBC 저장 pool의 역할을 수행한다.
  • 고양이를 제외하고 개, 말, 소에서는 비장의 sinusoids와 red pulp에 상당량의 RBC를 저장한다.
  • 말의 저장능이 가장 뛰어나다(50~60%의 RBC).
• Life span이 다하거나, 손상된 RBC들이 splenic macrophage에 의해 제거되는 기능도 있다.

고양이 spleen의 특징 (Closed circulation)

• 개, 말, 소에서는 open circulation이 이루어지고, 저장 능력이 높다.
  • open circulation : 혈류가 splenic artery에서 → sinusoid를 통해 비장 실질과 정맥을 통과하고 → 바깥으로 방출.
• 고양이의 비장은 closed circulation을 하기 때문에, RBC 저장보다는 면역 기능에 치중되어 있다.
  • Closed circulation : 비장 실질에 노출되지 않고 비장 동맥 → 정맥 → 다른 장기.
  • RBC들이 비장 실질의 macrophage에 노출될 일이 거의 없어 손상된 RBC를 제거하는 기능은 떨어진다.
  • 그래서 고양이의 혈액에서는 old cell들이 더 빈번하게 관찰된다.

Figure 복습

• Hemoglobin 합성은 reticulocyte(polychromatophil) 단계까지 일어난다는 점 기억.
• 개와 고양이에서, 빨간 네모의 두 세포(Reticulocytes & Mature RBCs)는 순환 혈중에서도 관찰될 수 있다.
• RBC precursor에서 Hgb 합성이 불충분하면 추가적인 mitoses가 일어나, 세포가 더 작아지더라도 Hgb 합성을 계속한다. ⇒ [Hgb] 부족하면 정상 RBC보다 더 작아질 때까지 분열이 일어난다는 것이 RBC의 특징!
• Spleen에서 RBC를 저장하고 있으며, 교감신경의 작용으로 수축하면 저장되어 있던 RBC가 갑자기 방출될 수 있음.
  • 말의 저장능이 50-60%로 가장 크다. (경주마 달리고 나서 채혈하면 RBC 수치가 어마어마..)
  • 그 외의 동물에서도, 교감신경이 자극되면 일시적으로 erythrocytosis가 나타날 수 있다.

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✅ 동물별 정상 RBC 비교

동물별 Blood erythrocyte 비교
Reticulocyte concentration	- 개와 고양이에서는 reticulocytes가 정상적으로 관찰된다. (1-2일 후 mature RBCs) - 말, 소에서는 정상적으로 관찰되지 않는다.
RBC life span	- 포유류의 평균 적혈구 수명은 120일 정도. - 고양이는 70일로 말, 소에 비해 절반 수준이다.
RBC diameter & volume	- 직경 차이는 크지 않다. - 적혈구 부피는 개에서 가장 크고, 말과 고양이에서 작다.
RBC central pallor	- 개에서는 뚜렷하게 관찰되나, 나머지 종에서는 불분명하다.

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Ⅲ. Hgb

구조, 기능은 읽어보기 (다 알죠?)

Hgb synthesis

• 헤모글로빈 합성은 RBC precursors로부터 일어난다. (rubriblast~reticulocyte까지)

Fig 3.2. Erythrocyte에서의 hemoglobin synthesis

• (1) Porphyrin reaction - (2) 철의 incorporation of Fe²⁺ - (3) Globulin의 binding
• 납 중독증(lead toxicity)
  → porphyrin reaction에 관여하는 효소의 기능이 억제됨
  → porphyrin이 계속 축적됨
  → porphyria 발생 (포르피린증: 적혈구, 혈장, 소변에 porphyrin 농도가 상승한 상태)
  • ferriheme & globin binding 과정도 억제되어 methemoglobin이 생김.
• lead toxicity로 인해 porphyria가 발생할 수 있다는 것은 알고 있자.

Hgb degradation

• Macrophage에서 일어난다: 비장, 간, 골수의 macrophage (RBC 제거와 동일)
• Hgb 분해 → Heme + globin → Heme이 [biliverdin + Fe²⁺ + CO]로 분해 → bilirubin 형성
  • 이 중 철과 아미노산은 재사용되어 hemoglobin 합성 등에 이용된다.

Fig 3.3. Bilirubin metabolism

• Hemoglobin의 분해 산물인 bilirubin은 장을 통해 분변으로 / 신장을 통해 urine으로 배출된다.
  • Unconjugated bilirubin은 주로 albumin과 binding된 형태로 순환 혈중에 존재한다.
  • 간세포에서 uptake되면 conjugation form으로 전환 → 배출된다.
• Hemolytic anemia로 용혈이 증가하면, 간세포의 conjugation 능력을 초과하여 황달이 발생할 수 있다.
  • 황달이 간세포에 의해서만 일어나는 게 아니라, 간 질환과 상관없이도 prehepatic이나 posthepatic jaundice가 발생할 수 있다는 점을 기억하자.

황달의 종류 3가지

• Bilirubin은 정상적으로 간세포에서 conjugation form으로 바뀌어 몸 밖으로 배출된다.
• Hepatic jaundice : 간세포에 문제가 생겨 unconjugated bilirubin이 증가
• Prehepatic jaundice : hemolysis가 많이 일어나 간세포가 conjugation 시킬 수 있는 능력을 초과함 - unconjugated bilirubin 증가
  << Hemolytic anemia에 의해 발생 가능
• Posthepatic jaundice : 신장 질환 등으로 인해 정상적으로 배출되지 못함
• 각각의 경우에서 관찰되는 bilirubin이 conjugated form인지 unconjugated form인지 구분할 수 있어야 함.

Ⅳ. Fe

• 생체 내 철은 주로 3군데에 분포한다.
  • (1) 체내 철의 50% 이상은 RBC hemoglobin 내에 존재.
  • (2) 25-40%는 저장형으로 존재 : plasma, tissue, ferritin, tissue macrophage 내의 hemosiderin 형태
  • (3) 그 외 아주 소량은 myglobin, cytochrome, enzyme 등에 존재.
• 생체 내에서 철 대사 이상이 발생하면 거의 RBC hemogloblin의 문제라고 보면 된다.

헤모글로빈 농도, 생체 내 철 저장 상태 등을 평가해야 하므로 철이 어디에 많이 존재하는지 알아야 함.

Absorption

• 철은 주로 식이(diet)를 통해 흡수된다.
• 간세포에서 생성되는 hepcidin 호르몬은 → 장에서의 철 흡수를 조절한다.
• 간세포에서 hypoxia 감지하면 hepcidin 생성이 바로 감소 → RBC가 철을 많이 이용 → hemoglobin의 합성이 증가한다.
• 염증 시 inflammatory cytokine 중 특히 IL-6에 의해 hepcidin 합성이 증가한다.

Fig 3.4. Fe kinetics in healthy animals

• 순환 혈중의 RBC 안에 Fe²⁺가 존재하고 있다.
• 장을 통해 흡수된 철은 순환 혈중에서 이온(Fe2+)이 아니라 transferrin 형태로 존재한다.
  • Transferrin = apotransferrin(철의 운반 단백질) + 철이 결합된 형태
  • 이 형태로 spleen, hepatic으로 이동하기도 한다.
• 혹은 혈중이나 조직에 ferritin 형태로도 저장되어 있다.

Ⅴ. Mature erythrocyte metabolism

• 대부분의 포유류의 RBC는 glucose를 에너지원으로 이용한다.
• 단, 돼지는 glucose transporter가 거의 없기 때문에 glucose 대신 inosine을 이용한다.

Ⅵ. Reticulocytes

(왼) NMB (오) Diff-quik

• 핵은 탐식되었으나 세포질에 staining 가능한 RBC 잔여물들이 아직 남아있다,
• NMB staining을 하면 → RNA 잔여물들이 reticulated basophilic structure 형태로 관찰된다.
  • NMB staining으로 reticulocyte를 명확하게 구분할 수 있다.
    그래서 빈혈 환자에서 [NMB staining → reticulocyte counting]은 자주 사용되는 방법이다.
  • NMB staining은 세포 배양 시 살아있는 세포의 cell counting에도 이용된다.
• 일반적으로 하는 Diff-quik나 Wright-staining에서는 polychoromatophilic erythrocyte 형태로 보인다.
  • 세포 크기가 조금 더 크고, central pallor가 불분명하며, 호산성이 조금 섞여 있는 염색성.
• Circulating reticulocytes가 개와 고양이에서 관찰될 수 있다 / 말과 소에서는 관찰되면 안 됨!
  • 1-2일 후 mature RBC가 된다.

Feline Reticulocytes의 종류

• 개와는 달리, 고양이에서 NMB staining을 하면 2가지 형태로 관찰된다.
  • (1) Punctate type : reticulum 적음 (2-6개 정도)
  • (2) Aggregate type : reticulum이 훨씬 많음, 골수에서 방출된 지 얼마 안 됨
• 다른 테스트에서는 Type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ로 구분하기도 한다.
  • Type Ⅰ (=punctate type) : reticulum 거의 없음. 방출된 지 오래 되어 life span은 3일 정도.
  • Type Ⅱ : life span은 12시간 정도 (12시간 지나면 type Ⅰ 형태로 바뀜.)
  • Type Ⅲ : reticulum이 가장 많음. 골수에서 방출된 지 가장 얼마 안 된 세포들.
    • life span은 12시간 정도, 빈혈 시작 후 4일 정도 지나야 concentration이 높아짐.
• 이러한 분류를 통해 blood loss 혹은 hemolysis가 얼마나 지속되었는지 평가할 수 있다.

• 왼쪽 : NMB staining로 확실하게 구분할 수 있다. (A=aggregate form, P=punctate form)
• 오른쪽 : Diff-quik staining에서는 핵 잔여물이 남아 있는 polychromatophilic RBC의 형태로 관찰된다.

RC, CRP

* RC : reticulocyte concentration, CRP : corrected reticulocyte percentage

• Correction이 필요한 것에는 WBC, reticulocyte가 있다.
• CRP(corrected)는 결국 Absolute reticulocyte percentage를 나타낸다.
• 건강한 동물에서는 거의 RC=CRP 이나, 빈혈이 있는 동물에서는 correction이 필요하다.
• CRP 공식 : 정상 PCV, 환자의 PCV, RP 값으로 구할 수 있다. 기계가 계산해주지만, 어떤 의미인지는 알고 있자!
  

• Reticulocytosis가 있다 = polychromasia가 증가했다, RC 증가, CRP 증가

• Reticulocytosis는 erythropoiesis가 증가했음을 의미한다.

• polychromasia의 정도(degree)는 reticulocytosis의 정도에 따라 증가한다.

동물별	Reticulocytosis
말 & 소	정상적으로 reticulocyte가 관찰되지 않는다.
	- 말 : Circulating polychromatophilic erythrocytes를 관찰하기가 거의 어렵다.
	- 소 : 빈혈 발생 3-4일 뒤 reticulotytosis가 나타나, 7-14일쯤 가장 높은 값을 나타낸다.
개	Bovine pattern : 소와 마찬가지로, 3-4일 이후 reticulocytosis가 나타나서 10일차에 가장 높은 값을 나타낸다.
	(blood loss 3일 이후 reticulocytosis 일어나는 것 확인)
고양이	aggregate form, punctate form에 따라 차이가 있다.
	polycythemia(RBC증가증)이 있는 고양이에서 Hct를 50% 수준으로 맞춰주기 위해 정맥절개술(phlebotomies)을 실시했을 때, - Aggregate reticulocytosis : 약 day 2에 관찰되고 4일째 peak, 9일째 다시 baseline으로 돌아갔다. - Punctate reticulocytosis : day 1에 나타나 7-14일째 peak를 기록하고 다시 baseline으로 돌아가지 않았다.
	(혈중에 더 많이 존재하는 것은 punctate form, aggregate form 또한 anemia로부터 시간차를 두고 증가하는 것 확인)

구체적인 날짜는 몰라도, 소와 개와 고양이에서 blood loss 이후 며칠의 시간차를 두고 reticulocytosis가 생긴다는 사실을 기억하자. >> 빈혈의 발생 시기를 역으로 추적할 수 있는 근거가 된다.

PCV와 RP 값

재생성 반응이 충분한 개와 고양이에서 HCT에 따른 RP

• 정상 (PCV=45%) : RP < 1.0% 가 일반적.
• 빈혈 (PCV 35~10%)
  • PCV가 감소하면서 골수가 정상적인 재생산을 한다면 RP가 4배 가량 증가함.
  • 고양이에서도 각 reticulocyte form에서 RP가 증가함.
  • Aggregate RP는 PCV 20~10%일 때 4배 이상 증가.

Hematocrit 결과 분석
* 혈액 원심분리 시 3,000rpm, 10min.
Normal (45%)
Anemia (30%) : hematocrit(PCV)의 감소 확인
Polycythemia (70%) (=erythrocytosis) : 정상에 비해 RBC volume이 크다. 점막이 pale한 것이 아니라, 반대로 아주 붉게 충혈된 것처럼 관찰된다.
Dehydration (70%) : hematocrit 증가, plasma 양 감소. 탈수 환자에서 관찰된다. (RBC가 실제로 증가한 게 아니라, 전체 volume이 줄어 상대적으로 RBC가 증가한 것처럼 보임.) : 구토, 설사, 화상(병원 온열 매트, 동물 학대) 시 나타날 수 있다.
⇒ Hematocrit만 봐도 빈혈 여부와 정도를 평가할 수 있다.

Ⅶ. Blood groups or types

• Blood group은 유전적 인자에 의해 결정된다.
• RBC가 가지는 antigen과 plasma가 가지는 antibody에 따라 수혈 가능 여부가 달라진다. 반드시 수혈 전 혈액형 검사 필요.

혈액형
개	- 적어도 12개 이상의 혈액형이 있으나, 주로 나타나는 것은 9가지. - DEA(Dog erythrocyte antigen)으로 나타내며, DEA 1.1과 1.2가 가장 많다. - Antigen을 가짐 = Positive(+) : universal recipients (가장 흔한 게 DEA 1.1+) - Antigen을 가지지 않음 = Negative(-) : universal donors (DEA 1.1-, 1.2-) - 최초 수혈 시에는 크게 문제되지 않으나, 그 이후로는 꼭 혈액형 검사 후 수혈.
고양이	- AB system으로 분류한다: Type A, B, AB. - 대부분의 고양이에서 type A가 가장 많다. (거의 모든 품종에서) - Type별로 RBC의 항체나 plasma의 항원 양에서 차이가 난다. - Group A는 anti-B를 가지긴 하지만 거의 없는 편이다. - Group B는 anti-A를 상당히 많이 가진다. 따라서 Group B에만 수혈 가능하다.

Analytic Principles and Methods

Ⅰ. Erythrogram

Erythrogram 평가 항목
1. Morphologic evaluation	- 적혈구는 morphology 또한 중요한 임상적 진단 요소. - 비정상 color, size, 모양, inclusion 여부 등
	ex) - Hgb 감소 → pale한 염색성, central pallor 확대 - Poikilocytosis(변형적혈구증가증) - 감염 → 병원체의 inclusion
2. HCT (=PCV)	- 전체 blood volume 중 RBC가 차지하는 비율
3. Blood [Hgb]	- 혈액 100ml당 Hgb 농도. - [RBC] 감소하면 혈중 [Hgb]도 감소함.
4. [RBC]	- 전체 blood volume 중 RBC의 개수. RBC의 absoulte count.
5. Wintrobe’s RBC indices	- 빈혈의 종류를 구분하기 위해 유용한 수치.
- MCV	Mean cell volume. (RBC의 평균 크기)
- MCHC	Mean corpuscular Hgb concentration. (혈구당 헤모글로빈의 농도)
- MCH	Mean corpuscular Hgb. (혈구당 헤모글로빈의 양)
	ex) - MCV 감소 = RBC가 많이 분열 = Hgb 부족 = 철 결핍성 빈혈
- RDW	RBC의 크기 차이를 나타내는 값. (RBC volume variation) - 표준 편차의 차이를 반영 : standard deviation of MCV ÷ MCV) × 100
	- Macrocytic : rouleaux, reticulocytosis 등 (재생성 빈혈 의심) - Microcytic : [Hgb] 낮아서 계속 분열 (철 결핍성 빈혈 의심) - 세포 크기가 커지든 작아지든 다 RDW는 증가.
6. nRBCs	- WBC correction 필요. - 5 nRBCs / 100 WBCs 이상이면 total WBC count에 영향을 미침. - Corrected WBC count = WBC × 100 / (nRBC+100)
7. Reticulocytes	- correction 필요 (corrected RP = absolute reticulocytes) - Reticulocytes는 동일한데 HCT 감소하면 → RP는 상대적으로 증가. ⇒ 환자의 reticulocytosis를 판단할 때는 CRP(corrected)를 기준으로. - 고양이는 개와 달리 aggregate form과 punctate form - blood loss(EPO 자극) 후 3-4일 뒤에 reticulocytosis 나타남.

Ⅱ. Methods

• RBC는 마찬가지로 CBC에서 구해지기 때문에 WBC와 거의 동일한 방법을 이용한다.
  • Microhematocrit
  • Impedance cell counters
  • Laser flow cell cytometers

(1) Microhematocrit

• 13,000rpm의 high-speed centrifuge가 필요하다.
  • ETDA, heparin tube에서는 3,000rpm 10분이었고, Urine이나 다른 fluid에서는 또 다르다.
  • Centrifuge의 시간과 강도는 세포가 얼마나 포함되어 있는지에 따라 달라진다.
• Buffy coat : centrifuge 후 RBC 부분 바로 위에 떠 있는 층.
  • WBC와 platelet을 포함한다.
  • 전체 혈액 volume의 0.5~1%를 차지한다.
  • buffy coat 층에 포함된 platelets로 PRP(platelet rich plasma)를 채취하기도 한다. (인의, 수의에서 치료 목적으로 많이 이용됨. 예를 들면 탈모 치료라든가..)

(2) Impedance cell counters

• 전기 저항 원리로 측정하는 방법.
• Large platelet과 small RBC를 정확하게 구분하지 못하기 때문에, 결과가 부정확할 수 있다.
  • Large platelet 관찰 = platelet의 생성이 증가했다 = 즉 platelet이 필요한 출혈 소견이 있음을 의미.
  • Small erythrocyte 관찰 = hemoglobin이 부족하여 mitoses가 계속 일어난다 = 즉, 철 결핍성 빈혈을 일으킬 수 있는 지속적인 출혈이 있음을 의미.
  • 이런 상태에서는 결과 해석에 주의할 것.
• 고양이 혈액의 경우 RBC와 platelet이 둘 다 작아 구분이 어렵기 때문에 역시 결과가 부정확하다.

(3) Laser flow cell cytometers

• 다양한 장점들을 가지며, Wintrobe’s erythrocyte indices를 구하기 좋다.

▶️ Cytogram 분석📋

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Morphologic Features of Erythrocytes: Clinical Significance and Pathogeneses

Ⅰ. Assessment

• 적혈구에서는 빈혈의 진단 및 종류 구분을 위해 morphology 평가가 매우 중요하다.
• 세포의 크기, 모양, 색깔 등 비정상 소견을 평가하면 된다. 대물렌즈 100배 크기에서 충분히 관찰 가능하다.
• poikilocytes의 심각도는 3-plus scale (1+~ 3+) 또는 4-plus scale (1+~ 4+) 로 나타낸다. (ex. 1+ polychromasia)
  • 직접 정의해도 됨. (ex. “1+ grade = 6 poikilocytes/300RBC로 표시한다.”)p

Ⅱ. General Features

Mature RBC = Discocytes (정상 적혈구)

• biconcavity 형태, 가운데가 움푹 들어가 있다.
• diff-quick staining에서 가운데 부분이 염색되지 않아 창백한 ‘central pallor’로 나타난다. (개)
• ‘Normocytes’라는 표현은 ‘정상적인 cell volume을 가진 세포’ + ‘정상적인 Hgb 양을 가진 세포’까지 포함하는 의미를 가진다.

Rouleaux formation or Agglutination

Rouleaux

• 적혈구의 aggregation으로 인해 coin 형태로 stacking된 것.
• 말과 고양이에서는 정상적으로 흔히 관찰된다.
• (1) Albumin factors, (2) globulin factors, (3) lipid 농도가 높아서 생긴 세포 사이의 전기적 결합이 원인. Plasma protein 농도의 영향일 때가 많다.
• Hyperglobulinemia, hyperfibrinogenemia가 있을 때 가장 흔하게 보인다. : 염증성 leukogram (cell membrane lipid 변화로 인해)
• 세포들이 적당한 간격을 두고 분포하는 feathered edge 부분에서도 plasma protein 농도가 높으면 관찰된다.

Agglutination

• RBC clotting → 포도송이 모양의 cluster를 형성한 것.
• Cold agglutination에 의해 나타난다.
• 대부분 immune-mediated로 발생해 IMHA에서 가장 흔하다.

Saline dilution : Rouleaux와 Agglutination 구분

• 모양만 보고 구분하기는 쉽지 않다.
• saline과 희석하면 plasma protein 농도가 낮아져 rouleaux는 보통 풀어진다.
• 방법
  1. Blood와 saline을 1:1로 섞어서 희석하면 대부분의 rouleaux formation에서는 풀어짐.
  2. 심한 경우에는 1)로 분산되지 않으나, 1:4 dilution까지 해보면 어느 순간 분산됨.

Rubricytosis

• Rubricytes : reticulocyte 전 단계의 모든 nRBCs를 말한다.
  • 임상적으로는 보통 바로 전 단계인 metarubricytes를 의미.
• Rubricytosis는 nRBC count의 증가를 의미하며, 재생성 빈혈에서 흔히 관찰되는 소견이다.
• 즉, 골수의 재생성 반응이 있는 빈혈에서 reticulocytosis뿐만 아니라 nRBC가 있는 rubricytosis도 관찰될 수 있다.
  • Erythropoiesis가 더욱 활발히 나타나고 있음(가속되고 있음)을 의미한다.

Appropriate / Inappropriate rubricytosis

• Appropriate rubricytosis : Reticulocytosis를 동반함.
  • 빈혈에 대한 반응으로 나타나는 적합한 신체의 재생성 반응.
  • 빈혈 → EPO 자극 → nRBC 생성 → Reticulocytes, Rubricytosis
• Inappropriate rubricytosis : 정상적인 과정이 아니라, Reticulocytosis를 동반하지 않음.
  • Erythropoiesis 과정의 이상으로 nRBC(metarubricytes)가 골수에서 말초혈로 바로 방출됨.

Inappropriate rubricytosis의 원인

1. 주로 Bone marrow에 문제가 생겨 발생함.
2. Extramedullary hematopoiesis, splenic contraction으로 인해 nRBCs 관찰.
   (Erythropoiesis 과정을 다 거치지 못해 nRBC인 채로 spleen이나 말초 혈액에 존재)
3. Splenectomy 이후 일정 기간 nRBC가 관찰될 수 있음.
4. Lead poisoning(납 중독증)일 때 bone marrow 손상을 유발할 수 있음.
5. Poodle에서 나타나는 bone marrow dyscrasia : macrocytosis와 nRBC가 골수와 말초혈에서 두드러지게 관찰되는 품종 특이적 유전성 질환.

Ⅲ. RBC Color

Central pallor	- Central pallor 확장 → 염색되는 부분이 감소, 즉 Hgb 양이 적다는 의미. (“hypochromasia”) - Central pallor 감소 → RBC 모양에 이상이 생길 때(poikilocytes) 자주 보인다.
Spherocytes	- 크기가 작고, central pallor가 감소한 형태. 직경 대비 Hgb 농도가 높음. - Macrophage의 partial phagocytosis에 의해 나타난다. (= macrophage에 완전히 탐식되지 못함 = 탐식이 감소함) - RBC가 크고 central pallor가 명확한 개에서 쉽게 구분되지만, 고양이에서는 잘 구분되지 않는다. - Fragmentation이 쉽게 일어나 hemolytic anemia를 유발한다. (IMHA와 관련해서 특징적으로 관찰된다.)
Ghost cell	- Hgb 양이 아주 적게 남아 매우 창백하게 관찰되는 적혈구. - 용혈이 심해 세포막을 통해 Hgb이 유출, 염색성이 낮아진다. - 보체 매개성 혈관내 용혈성 빈혈에서 관찰된다.
Hypochromic RBC	- Hgb 양이 감소해 central pallar가 확대된 적혈구.
Polychromatophilic erythrocyte	- Reticulocyte가 diff-quick이나 wright-giemsa 염색에서 관찰되는 모습.

남내_Spherocytes (구상적혈구)

• 항체로 코팅된 적혈구막 일부가 탐식되어, 크기가 작아지고 창백한 중앙부가 소실된 적혈구 형태
  ⇒ loss of the normal discoid shape, decreased size, loss of central pallor
• 과정 : Mononuclear-phagocytic cells가 적혈구의 항원에 부착, Fc receptor와 결합 → 세포질과 막이 뜯겨짐(“bites off”) → 남은 애들끼리 뭉쳐서 더 작고, central pallor가 없는 spherocyte 형성
• 면역 용혈 빈혈뿐만 아니라 Babesia gibsoni 감염, 아연 독성, hemophagocytic malignant histiocytosis, 보관한 지 오래된 피를 수혈했을 때도 나타날 수 있는 특징.
  • 개 : 주로 immune hemolysis에 의해
  • 고양이: 면역보다는 Drug-associated hemolysis(β-lactam 항생제 잘못 먹었을 때), mycoplasmosis + IHA 등에 의해 나타날 때가 많음
• 정상 적혈구보다 단단(more rigid), 잘 변형되지 않음(less deformable), 비장을 통과하면서 제거됨.

Ⅳ. RBC Organisms

Table 3.5 Erythrocyte organisms

• Anaplasma, Babesia 등의 pathogen들이 RBC 내에서 inclusion 형태로 관찰된다.
  • pathogen의 종류에 따라 모양은 다르다.
  • Morphology만으로 확진은 어려우나, 임상 증상과 PCR로 확진할 수 있다.

Ⅴ. RBC Inclusions (other than organisms)

Pathogen 외의 요인으로 나타나는 inclusion.

Table 3.6 Erythrocyte inclusions other than organisms

이 3개 정도는 알자!
Howell-Jolly body	- RBC 내부에 핵의 잔여물이 남음 - Erythropoiesis가 활발할 때 관찰됨. (그러나 건강한 포유류에서도 종종 관찰될 수 있으며, 특히 고양이에서 빈번하게 관찰.)
Basophilic stippling (큰 화살표)	- RNA 잔여물이 남아 더 작은 dark-purple dots가 관찰됨. - 역시 RBC 생성이 활발해서 나타내는 형태.
Heinz body (왼: pale staining → 가장자리 날아간 것처럼 보임 / 오: NMB에서 blue color)	- 연한 염색성(slightly pale)의 동그란 구조물이 막에 부착된 형태. - 산화적 손상에 의해 변성된 Hgb가 세포막에 축적되어 나타남. - 산화적 손상의 원인으로는 acetaminophen 중독, 양파 중독, 약물 등이 있음. - Diff-quik에서는 pale한 염색성 / NMB에서는 blue color로 나타남. - 변성된 Hgb이 축적되어 cell membrane이 유약해지기 때문에 쉽게 용해될 수 있음. ⇒ Heinz body가 보이면 Hemolytic anemia인 것을 의미.

Ⅵ. Abnormal Erythrocyte Volume

• Anisocytosis : RBC volume의 비정상적인 variation
  • Macrocytosis나 microcytosis (or both) 가 관찰됨
• Macrocytic = MCV 증가
  • Poodle의 inappropriate rubricotysis에서 macrocytosis도 같이 관찰될 수 있음.
  • Reticulocytes도 macrocytic한 세포.
• Microcytic = MCV 감소
  • 철 결핍성 빈혈(3개월 코피 흘렸던 케이스) : 지속적 출혈, 재생성 반응 적고 microcytic
  • 철 결핍뿐만 아니라 간 질환(portosystemic shunts), 구리 결핍 등에서도 나타남.
  • 특정 품종에서 정상적으로 RBC가 작게(microcytic) 관찰됨. (Akitas, Shibas, Jindos, chow-chows, shar-peis)
  • Spherocyte도 부피, 직경 감소된 microcyte의 한 종류. (Macrophage에 의해 partial phagocyte되어 직경도 감소.)

Ⅶ. Abnormal Erythrocyte Shape

Artifact로 관찰될 수 있는 것들, morphology 평가 시 주의.

Poikilocytes
Acanthocytes (Spur cell)	- 불규칙한 형태의 spicules(돌기) 관찰. - Cholesterol 양의 변화로 세포막의 phospholipid 층에 변화가 생김. - Splenic and hepatic diseases, splenic hemangiosarcoma : 비장, 간 질환 관련해서도 나타날 수 있음. - Microangiopathy : chemical injury에 의해 비장의 정상 혈관 크기에 비해 혈관 내강이 좁아지는 질환.
Target cells, Codocytes	- central pallor가 위로 솟아서, 진짜 과녁 모양으로 관찰됨. - 원인 ; Hgb 농도 감소, 간 질환, splenectomy 이후, 철 결핍(빈혈)
Dacrocyte (Tear-drop cell)	- Tear drop cell, tennis racket cell. 꼬리를 가진 것처럼 나타남. - 동물에서는 드물고, 사람에서는 심각한 빈혈 지표로서 임상적 의의가 있음.
Mycoplasma haemofelis	- Howell Jolly와 비슷하나, - cytoplasm 내측에 존재하는 Howell-Jolly와 달리 Mycoplasma haemofelis는 cell membrane에 가깝게 위치하고, 400배에서 보면 핵 잔여물과 달리 완전 round한 형태가 아님. - PCR 진단 필요.
Echinocyte	- RBC fragment처럼 보이는 불규칙한 spicule을 가지고 있음.
Stomatocyte	- RBC 사이 slit이 있음. - 개에서 품종 소인에 의해 유전성으로 관찰되기도 함.
Schizocyte	- RBC fragment의 하나. Acanthocytes와 유사하게 생김. - Intravascular coagulation이나, vasculitis에 의해 혈관 내강이 좁아져 혈류 속도에 변화가 생기면서 발생.

Anemia

Ⅰ. General information

• 빈혈 : [RBC] 감소, [Hgb] 감소, Hct 감소한 Pathologic state (병리적 상태)
  • 혈액 감소 → RBC loss 증가
  • RBC 파괴 증가
  • 골수에서 RBC 생산 제한 (EPO 생산 문제 등)
• 임상 소견 : Exercise tolerance 감소, Weakness, Depression, Tachypnea(빈호흡)
  • 혈중 O2가 부족하기 때문
• 신체 검사 소견 : 창백한 mucous membrane color (잇몸, 결막, 질 등)
  • 말초 혈관의 혈액이 부족하기 때문
  • 심각한 빈혈에서는 심잡음 (systolic heart murmur)

Ⅱ. Classifications of anemias

⏺️ Bone marrow의 반응성

• Reticulocytosis 관찰 여부에 따라 재생성/비재생성으로 구분됨.

Regenerative anemia (재생성 빈혈)	Nonregenerative anemia (비재생성 빈혈)
혈액 소실이나 용혈에 대한 반응으로 나타남.	골수의 반응성이 없어지거나, RBC 생성에 문제가 생겨 나타남. RBC precursor cell이 손상을 받는 경우.
Reticulocytosis 관찰됨. (RC ↑, CRP ↑, polychromasia ↑) Rubricytosis와 동반되기도 함. (nRBC 관찰)	Production의 문제일 뿐 존재하는 RBC에는 영향이 없으므로 Normocytic, Normochromic anemia.
Macrocytic hypochromic, anisocytosis (RDW 증가), Howell-Jolly bodies, codocytes(target cell), basophilic stippling 관찰	주로 골수의 문제 → Erythroid hypoplasia, marrow aplasia, red cell aplasia, myelofibrosis, myelitis, myelophthisis, ineffecitve erythropoiesis

비재생성 빈혈을 일으킬 수 있는 원인

Reduced erythropoiesis

• 염증성 질환 (primarily chronic)
  • 감염성 (bacterial, fungal, viral, protozoal, parasitic
  • 비감염성
• 신장 질환 (chronic) : 신장 실질 세포가 섬유화 (renal fibrosis) → Epo 생성 불가
• Bone marrow hypo/aplasia 유발 질환
  • 감염원 (bacterial, fungal, viral, protozoal)
  • Toxicosis (chemotherapeutic agents, estrogen, bracken fern, phenylbutazone)
  • Irradiation (whole body or environmental)
  • 골수 종양 or replacement (neoplasia, myelofibrosis, osteopetrosis)
• Selective erythroid hypo/aplasia 유발 질환
  • PRCA (pure red cell aplasia)
  • FeLV-induced erythroid hypoplasia
  • 내분비 (hypothyroidism, hypoadrenocorticism, hypoandrogenism, hyperestrogenism
  • 간 질환, 간 부전 (PSS; portosystemic shunts 포함)

Ineffective erythropoiesis

• Nutritional : Fe, Cu, Cobalt, Folate, Vitamin B12 deficiency
• Immune-mediated nonregenerative anemia
• Dyserythropoiesis of English springer spaniels
• Congenital dyserythropoieses of polled Hereford calves

⏺️ RBC indices에 따른 세포의 mophologic classification

MCV (RBC 크기)	MCHC (Hgb 양)
Normocytic	Normochromic	빈혈인데 Normo, Normo : 비재생성 빈혈의 가장 전형적인 특징. (생성이 감소할 뿐, 미성숙 RBC가 방출되는 것 X)
Macrocytic	Hypochromic Normochromic	Macrocytic ⇒ Reticulocytosis (hypochromic, normochromic 둘 다)
Microcytic	Hypochromic Normochromic	세포의 크기가 작아진 것은 철 결핍성 빈혈을 시사함. (철 결핍 → Hgb 합성 장애 → Hgb 합성을 완성시키 기 위해 mitosis가 일어나 세포의 크기가 작아짐.)
Normocytic	Hypochromic	(실제로 거의 관찰되지 않는다고 하나, case 분석했던 내용을 보면 이 경우도 Reticulocytosis 과정 중에 있다고 생각하면 될듯함)
-	Hyperchromic	거의 관찰되지 않음. 검사 이상이 의심됨.

⏺️ Pathophysiologic classification

1) Blood loss에 의한 빈혈

Acute blood loss	Chronic blood loss
몇 시간~며칠 동안 발생.	수 주~수 개월 장기간 지속.
골수가 반응하여 재생성 빈혈	특히 철 고갈로 인해 골수의 재생성 기능이 감소하고, 비재생성 - 철 결핍성 빈혈

External blood loss	Internal blood loss
몸 밖으로 유출되는 일반적인 출혈. 소화계나 비뇨계를 통해 인지 가능한 확실한 소견이 나타남.	혈관 내에서 혈관 밖으로 이동하는 출혈. 보호자가 인지하기 어려워 만성으로 진행될 때가 많음.
	대표적으로 복강/흉강(peritoneal/pleural cavities)에 혈액이 차는 혈복수, 혈흉수

2) Hemolytic anemia

Extravascular hemolysis	Intravascular hemolysis
혈관 밖에서 나타남.	혈관 내에서 나타남.
주로 splenic/hepatic macrophage에 의함.	대표적으로 IMHA, heinz body anemia 등.

3) RBC 생산 감소에 의한 anemia

• 염증성 질환, 신장 질환, 골수 저형성/무형성, erythroid 저형성 등 (위 비재생성 빈혈 원인 참고)

Ⅲ. Erythrocyte kinetics

Acute blood loss	Chronic blood loss
빈혈 + Hypoproteinemia (그래서 TP 농도로도 blood loss 파악 가능)	철 결핍성 빈혈 → Micocytic hypochromic RBCs
혈관에서 RBCs & plasma protein 소실 → Hypovolemia 발생 → ECF가 혈관내로 이동해 채움 → 혈관내 RBC가 더욱 희석한 것으로 인식 → 비장이 수축하여 저장된 RBCs 방출	RBCs, plasma proteins, 철이 같이 소실 (골수의 erythropoiesis 반응 있음) → 장기간 지속되며 저장된 철이 고갈, 초기에 비해 골수의 erythropoiesis 감소 → 생체내 철이 고갈. 철 결핍성 빈혈.

Nonregenerative Anemias

Ⅰ. General concepts

Ⅱ. Disorders that cause nonregenerative anemias

Blood loss Anemias

Ⅰ. Causes of blood loss

Ⅱ. Classification based on duration and location

Hemolytic Anemias

Ⅰ. Concepts and classifications

Ⅱ. Hemolytic disorders and diseases

IMHA (Immune-mediated hemolytic anemia)

• 개의 가장 흔한 extravascular hemolysis 원인.
• Spherocyte 형성이 가장 큰 특징. RBC rupture로 ghost cell도 관찰된다.
  • Ghost cell은 RBC 손상, 특히 intravascular hemolysis의 중요한 특징이다.

Spherocye는 IMHA의 주요 특징, ghost cell은 intravascular hemolysis의 주요 특징!

TIBC

• Apotransferrine + Fe3+ 결합

Erythrocytosis and Polycythemia

Ⅰ. Terms and concepts

Ⅱ. Erythrocytotic disordes and conditions